РНК/ДНК возбудителей инфекций, передающихся иксодовыми клещами (клещевой энцефалит, боррелиоз, анаплазмоз, эрлихиоз), исследование клеща в Чусовой

ОПИСАНИЕ

Комплексное исследование методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с целью выявления возбудителей клещевого энцефалита (Tick-borne encephalitis virus), боррелиоза (Borrelia burgdorferi), моноцитарного эрлихиоза человека (Ehrlichia chaffeensis) и анаплазмоза человека (Anaplasma phagocytophilum) в клеще.

Инфекции, возбудители которых передаются человеку иксодовыми клещами Ixodes persulcatus и Ixodes ricinus составляют большую группу инфекционных заболеваний разнообразных по этиологии и клиническим проявлениям. Среди них наибольшую актуальность представляют иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ),  клещевой энцефалит (КЭ), моноцитарный эрлихиоз человека (МЭЧ), гранулоцитарный анаплазмоз человека  (ГАЧ), что обусловлено их широкой распространенностью, большой социально-экономической значимостью из-за высокой заболеваемости населения. Клещевые инфекции имеют ряд общих свойств:

• заражение человека происходит при укусе инфицированным клещом.
•  характерна весенне-летняя сезонность, связанная с периодами активности и повышенной численности клещей.

• клещи могут быть инфицированы сразу несколькими патогенами. Присасывание такого клеща может вызвать развитие у человека микст-инфекции, которая протекает более тяжело.
• клиническая картина имеет много общих черт и неспецифична. Как правило, заболевание манифестирует в виде гриппоподобного синдрома с лихорадкой, головной болью, миалгией и артралгией. Дифференцировать клещевые инфекции между собой и с другими острыми инфекционными на основании только лишь клинической картины заболевания практически невозможно.

Природные очаги данных инфекций ассоциированы преимущественно с лесными ландшафтами умеренного климатического пояса, наиболее активные их них связаны с широколиственной, смешанно-широколиственной или южно-таежной формациями растительности.

Сезон активности иксодовых клещей начинается в последней декаде апреля и продолжается в средней полосе России, как правило, до октября, а в Приморье – до ноября.

Чаще всего клещи прикрепляются к одежде человека в лесу, когда он перемещается, касаясь ветвей деревьев, раздвигая кустарники и травостой, или садится на траву. В случаях, когда клещи заносятся в жилище на шерсти домашних животных, предметах одежды или других вещах, вынесенных их леса, присасывание возможно спустя несколько дней после выхода человека из эндемичного очага.

С момента заползания клеща на одежду человека до начала кровососания проходит 1-2 часа. У человека клещ присасывается чаще всего в области шеи, груди, подмышечных впадин, паховых складок, т.е. в местах с тонкой кожей и обильным кровоснабжением. У детей относительно частым местом прикрепления клеща является волосистая часть головы и заушные области. Прикрепление и присасывание клеща к телу в большинстве случаев остаются незамеченными, так как в состав его слюны входят анестезирующие, сосудорасширяющие и антикоагулирующие вещества. Ощущение человеком саднения и зуда на месте присасывания клеща может появиться отсрочено через 6-12 часов или вовсе отсутствует. Процесс полного насыщения кровью самок иксодовых клещей может продолжаться 6-8 дней, однако передача возбудителей обычно происходит в первые сутки.

Клещевой энцефалит - возбудителем заболевания является РНК-содержащий вирус Tick-borne encephalitis virus. Переносчиком инфекции являются иксодовые клещи Ixodess capularis, Ixodess ricinus, Ixodess pacificus и Ixodess persulcatus. В России наибольшее значение имеют виды Ixodess ricinus и Ixodess persulcatus. Наибольшее количество вируса накапливается в кишечнике, половом аппарате и слюнных железах и сохраняется в течение всего периода жизни насекомых.  Количество зараженных вирусом клещей в очагах может колебаться от единичных особей до 2-5% и даже до 40%. Вирус способен зимовать в теле клеща и передаваться. Дополнительным резервуаром вируса являются грызуны, дикие животные и птицы - размножение вируса может происходить в организме более 130 видов животных (кроты, мыши, дикие и домашние животные). В природных очагах вирус клещевого энцефалита циркулирует по цепи: иксодовые клещи – дикие позвоночные животные - иксодовые клещи. Заражение клеща происходит при укусе и кровососании инфицированных животных.

Заражение человека вирусом происходит двумя путями: трансмиссивным через укусы клеща и алиментарным при употреблении в пищу сырого козьего молока и молочных продуктов из него. При трансмиссивном пути инфицирования заражение происходит при кровососании вирусофорных клещей. Наибольшее эпидемиологическое значение имеют самки клещей, которые способны присасываться на длительный период (до 5-8 суток) и вводят большее количество вирусов. Кровососание самцов длится обычно несколько часов и часто остается незамеченным.

Передача вируса клещевого энцефалита человеку может произойти в первые минуты присасывания высоковирусофорного клеща. Удаление насекомого при сохранении «цементирующей пробки», содержащей вирус слюны клеща, в коже человека полностью не устраняет передачу инфекции. В одном высоковирусофорном клеще может содержаться преизбыточная доза возбудителя инфекции - до 1000 вирусных частиц, попадание в кровь человека одной миллионной доли вирусного пула бывает достаточно для развития инфекции.

Болезнь Лайма (клещевой боррелиоз) - возбудитель заболевания спирохета Borrelia burgdorferi. Естественная зараженность взрослых клещей Borrelia burgdorferi обычно высока и может достигать 30 - 60%. Показатели зараженности боррелиями у Ixodess ricinus ниже, чем у  Ixodess persulcatus. У подавляющего большинства инфицированных клещей возбудитель содержится в кишечнике, лишь у небольшого процента особей возбудитель проникает в полость тела, слюнные железы и гонады. Вероятно, такие клещи способны принимать дальнейшее участие в поддержании популяции возбудителя в природе. Инфицирование человека боррелиями происходит преимущественно в результате присасывания самки клеща.

Боррелии со слюной клеща попадают в кожу и в течение нескольких дней размножаются, после чего они распространяются  на другие участки кожи и внутренние органы (сердце, головной мозг, суставы). Боррелии в течение длительного времени могут сохраняться в организме человека, обусловливая хроническое и рецидивирующее течение заболевания.  

Анаплазмоз, ранее известный как гранулоцитарный эрлихиоз, возбудителем заболевания является бактерия Anaplasma phagocytophilum, особенность которой – необычный тропизм к лейкоцитарным гранулоцитам. Anaplasma phagocytophilum имеет округлую форму, диаметр клетки до 1 мкм, размножается делением Anaplasma phagocytophillum обнаруживается в тех же очагах, что и патогенные для человека виды боррелий и другие виды возбудителей заболеваний, передаваемых клещами. Основным резервуаром и переносчиками инфекции являются иксодовые клещи. Резервуаром инфекции в природе, кроме клещей, являются животные: грызуны, олени, собаки, а также птицы, миграция которых способствует распространению инфицированных клещей в другие регионы. Анаплазмия у животных сохраняется в течение нескольких недель, в этот период они становятся источником инфекции для ранее интактных клещей на всех стадиях их развития. Предполагается трансовариальная передача анаплазм клещами. Заражение человека происходит трансмиссивным путем при укусе инфицированными клещами. Больной человек не представляет опасности для окружающих как источник инфекции.

Патогенез на начальной стадии обусловлен процессом внедрения возбудителя в организм человека через кожу, первичный аффект, как правило, отсутствует. Со слюной клеща возбудитель проникает в подлежащие ткани и распространяется гематогенным путем по всему организму. Анаплазмы инфицируют гранулоциты, в первую очередь зрелые нейтрофилы. Внутри цитоплазмы лейкоцитов формируются морулы – колонии зрелых бактерий. При инфицировании клеток-мишеней происходит внедрение в клетку, размножение в цитоплазматической вакуоли и выход из клетки. Процесс сопровождается поражением макрофагов селезенки, печени, лимфатических узлов, костного мозга и других органов, вызывая воспалительные процессы в них. Поражение лейкоцитов и воспалительные изменения во внутренних органах сопровождаются угнетением защитных механизмов организма и способствуют присоединению бактериальных, грибковых, вирусных инфекций.

Моноцитарный эрлихиоз - возбудителями заболевания являются внутриклеточные бактерии Ehrlichia chaffeensis и Ehrlichia muris. Переносчик инфекции – иксодовые клещи. В Пермской области моноцитарные эрлихии у таежных клещей Ixodes persulcatus впервые были обнаружены в 1997 году.

После укуса клеща эрлихии через кожу со слюной инфицированного клеща поступают в циркулирующую кровь, где они размножаются внутри моноцитов, макрофагов и нейтрофилов. Внутри вакуолей моноцитов происходит размножение эрлихий, формируются микроколонии, так называемые морулы (2-5 мкм). При этом изменяются защитные механизмы клеток хозяина, что способствует выживанию данных микроорганизмов. Характерная особенность эрлихий и анаплазм – отсутствие важных компонентов клеточной мембраны, таких как липополисахариды и пептидогликаны. В то же время клеточная стенка эрлихий богата холестерином, который является производным от клеток хозяина и необходим для проникновения в клетки млекопитающих и выживания эрлихий.

Таким образом, эрлихии и анаплазмы имеют схожую морфологию, трансмиссивный характер инфицирования, единый механизм проникновения в клетки-мишени. Особенностью данных микроорганизмов является различный тропизм к клеткам крови. Так, Anaplasma phagocytophilum поражают лейкоцитарные гранулоциты (в основном нейтрофилы), а Ehrlichia chaffeensis обладают тропизмом к моноцитам, что и дало название передаваемым ими болезням (гранулоцитарный анаплазмоз человека, моноцитарный эрлихиоз человека). Продолжительность инкубационного периода данных инфекций составляет в среднем 14 дней (3-23 дня). Клинические проявления анаплазмоза и эрлихиоза неспецифичны и чаще характеризуются лихорадкой (97%), головной болью (80%), миалгией (57%) и артралгией (41%). Редко может наблюдаться неспецифическая сыпь (10%), которая может быть макулопапулезной, петехиальной, или проявляться как диффузная эритродермия, но она, как правило, не затрагивает лицо, ладони и подошвы стоп. Тошнота, рвота, боль в животе, а также кашель наблюдаются непостоянно. Желудочно-кишечные проявления, в том числе диарея и анорексия, отмечаются при эрлихиозе в основном у детей. Довольно тяжело эрлихиоз может протекать у пожилых людей и пациентов с иммунодефицитом, однако описаны случаи с летальным исходом у лиц с нормальным иммунным статусом. В силу такой неспецифичности клинических провлений постановка предположительного диагноза анаплазмоза и моноцитарного эрлихиоза должна основываться на комплексной оценке эпидемиологического анамнеза, лабораторных данных и клинической картины заболевания. Для постановки окончательного диагноза необходимо провести исследования, направленные на выявление специфических маркеров возбудителя (антигенов, антител, генома), подтверждающих этиологию заболевания.

Учитывая эти особенности, при подозрении на клещевую инфекцию необходимо комплексное лабораторное исследование, включающее анализы на все значимые возбудители клещевых инфекций.

ПЦР – это один из методов молекулярной диагностики, позволяющий выявлять в биологическом материале фрагменты генетического материала (ДНК, РНК) возбудителя инфекции. Исследование обладает целым рядом преимуществ по сравнению с другими методами идентификации клещевых инфекций: быстрота получения результата, высокая чувствительность метода, высокая специфичность. Специфичность метода особенно важна для дифференциальной диагностики клещевых инфекций. Известно, что,  серологические тесты на клещевые инфекции часто дают ложноположительный результат из-за наличия перекрестных реакций, обусловленных общими антигенными свойствами указанных микроорганизмов. Так как в ПЦР используются специфические для каждого из микроорганизмов праймеры, вероятность ложноположительного результата гораздо ниже.

 

ПОДГОТОВКА К ИССЛЕДОВАНИЮ

При наличии клеща проводят его удаление. Присосавшегося к телу клеща необходимо удалить сразу после обнаружения, стараясь не оторвать погруженный в кожу хоботок и головку.

 

Материал для исследования: иксодовые клещи, для исследования пригодны живые и мертвые особи.

ПОКАЗАНИЯ

• Определение инфицирования клеща в целях своевременной диагностики клещевого энцефалита,  боррелиоза, моноцитарного эрлихиоза и анаплазмоза, экстренной специфической профилактики и проведения целенаправленного патогенетического лечения.

 

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Интерпретация результатов содержит аналитическую информацию для лечащего врача. Лабораторные данные входят в комплекс всестороннего обследования пациента, проводимого врачом и не могут быть использованы для самодиагностики и самолечения.

 

Исследование предполагает определение в клеще фрагментов генетического материала (ДНК, РНК) возбудителей клещевого энцефалита, боррелиоза, моноцитарного эрлихиоза человека, анаплазмоза человека. Тест является качественным, результат выдается в терминах «обнаружено», «не обнаружено». Положительный результат свидетельствует об инфицировании клеща.

При обнаружении маркеров возбудителей инфекций, передающихся иксодовыми клещами, необходимо обратиться за медицинской помощью к врачу-инфекционисту, а при его отсутствии - врачу-терапевту для принятия мер экстренной профилактики. Экстренную специфическую профилактику инфекций, передающихся иксодовыми клещами, необходимо проводить в течение 72 часов после присасывания под наблюдением медицинских работников (СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней").

Причинами отрицательного результата, может быть, отсутствие инфицирования исследуемого клеща клещевыми инфекциями, содержание возбудителя в исследуемом материале ниже уровня детекции, ложноотрицательные результаты.