РНК/ДНК возбудителей инфекций, передающихся иксодовыми клещами (клещевой энцефалит, боррелиоз, анаплазмоз, эрлихиоз), кровь в Добрянка

ОПИСАНИЕ

Комплексное исследование методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с целью выявления возбудителей клещевого энцефалита (Tick-borne encephalitis virus), боррелиоза (Borrelia burgdorferi), моноцитарного эрлихиоза человека  (Ehrlichia chaffeensis/ Ehrlichia muris) и анаплазмоза человека (Anaplasma phagocytophilum) в крови.

Инфекции, возбудители которых передаются человеку иксодовыми клещами Ixodes persulcatus и Ixodes ricinus составляют большую группу инфекционных заболеваний разнообразных по этиологии и клиническим проявлениям. Среди них наибольшую актуальность представляют иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ),  клещевой энцефалит (КЭ), гранулоцитарный анаплазмоз человека  (ГАЧ), моноцитарный эрлихиоз человека (МЭЧ), что обусловлено их широкой распространенностью, большой социально-экономической значимостью из-за высокой заболеваемости населения.

Природные очаги данных инфекций ассоциированы преимущественно с лесными ландшафтами умеренного климатического пояса, наиболее активные их них связаны с широколиственной, смешанно-широколиственной или южно-таежной растительностью. Сезон активности иксодовых клещей начинается в последней декаде апреля и продолжается в средней полосе России, как правило, до октября, а в Приморье – до ноября.

Чаще всего клещи прикрепляются к одежде человека в лесу, когда он перемещается, касаясь ветвей деревьев, раздвигая кустарники или садится на траву. В случаях, когда клещи заносятся в жилище на шерсти домашних животных, предметах одежды или других вещах, вынесенных их леса, присасывание возможно спустя несколько дней после выхода человека из эндемичного очага.

С момента заползания клеща на одежду человека до начала кровососания проходит 1-2 часа. У человека клещ присасывается чаще всего в области шеи, груди, подмышечных впадин, паховых складок, т.е. в местах с тонкой кожей и обильным кровоснабжением. У детей относительно частым местом прикрепления клеща является волосистая часть головы и заушные области.

Ротовой аппарат клещей относится к режуще-сосущему типу и состоит из хоботка   (гипостома) и челюстей (хелицер), которые разрезают кожу. Внутри хоботка находится предротовая полость, куда открываются протоки слюнных желез. При прокусывании кожи гипостом проникает через всю толщу эпидермиса, достигая дермы. Присосавшегося клеща удалить очень сложно из-за мешающих хитиновых зубчиков. Продолжительность присасывания самок – до 6-8 суток. При этом объем её тела увеличивается в 10-80 и более раз. Самцы присасываются на короткий срок - от нескольких минут до нескольких часов, но они также как и самки являются переносчиками вируса. Процесс питания состоит из кратковременных актов впрыскивания слюны, перемежающихся с всасыванием крови, поэтому, чем дольше клещ находиться на теле, тем большая инфицирующая доза возбудителя попадает в организм позвоночного хозяина. Слюна клеща содержит сосудорасширяющие, антикоагулирующие, а также анестезирующие вещества, поэтому укусы клещей, как правило, безболезненны, ощущение человеком саднения и зуда на месте присасывания клеща может появиться отсрочено - через 6-12 часов.

Процесс полного насыщения кровью самок иксодовых клещей может продолжаться 6-8 дней, однако передача возбудителей обычно происходит в первые сутки.

Клещевой энцефалит - возбудителем заболевания является РНК-содержащий вирус Tick-borne encephalitis virus. Наибольшее количество вируса накапливается в кишечнике, половом аппарате и слюнных железах клещей и сохраняется в течение всего периода жизни насекомых.  Количество зараженных вирусом клещей в очагах может колебаться от единичных особей до 2-5% и даже до 40%. Вирус способен зимовать в теле клеща и передаваться. Дополнительным резервуаром вируса являются грызуны, дикие животные и птицы - размножение вируса может происходить в организме более 130 видов животных (кроты, мыши, дикие и домашние животные). В природных очагах вирус клещевого энцефалита циркулирует по цепи: иксодовые клещи – дикие позвоночные животные - иксодовые клещи. Заражение клеща происходит при укусе и кровососании инфицированных животных.

Заражение человека вирусом происходит двумя путями: трансмиссивным через укусы клеща и алиментарным при употреблении в пищу сырого козьего молока и молочных продуктов из него. При трансмиссивном пути инфицирования заражение происходит при кровососании вирусофорных клещей.

Передача вируса клещевого энцефалита человеку может произойти в первые минуты присасывания высоковирусофорного клеща. Удаление насекомого при сохранении «цементирующей пробки», содержащей вирус слюны клеща, в коже человека полностью не устраняет передачу инфекции. В одном высоковирусофорном клеще может содержаться преизбыточная доза возбудителя инфекции - до 1000 вирусных частиц, попадание в кровь человека одной миллионной доли вирусного пула бывает достаточно для развития инфекции.  После присасывания клеща вирус распространяется гематогенно,  быстро проникает в мозг, фиксируясь в клетках. Наиболее чувствительны к вирусу  нервные клетки передних рогов шейного отдела спинного мозга и ядра продолговатого мозга. Параллельно с накоплением вируса развиваются воспалительные изменения в сосудистой стенки и оболочках головного мозга. Возможен и лимфогенный путь проникновения вируса в центральную нервную систему. Возникновение менингеальных и менингоэнцефалитических синдромов соответствуют гематогенному, а полиомиелитических и радикулоневритических – лимфогенному пути распространений вируса. Характер течения болезни определяется путем внедрения, свойствами и дозой возбудителя, а также резистентностью и реактивностью микроорганизма.

Вирусемия при клещевом энцефалите имеет двухволновый характер. В эксперименте на белых мышах показано, что кратковременная первичная вирусемия наблюдается через 12-24 часа  после заражения. Повторная вирусемия наблюдается в конце инкубационного периода и  совпадает по времени с размножением вируса во внутренних органах и появлением его в центральной нервной системе.

Инкубационный период заболевания длится от 3 до 21 дней, в среднем 10-14 дней. Клинические проявления носят разнообразный характер. Начальная фаза заболевания характеризуется лихорадкой, головной болью, миалгиями, возможно присоединение тошноты, рвоты, светобоязни. Далее развивается фаза неврологических расстройств, при которой происходит поражение центральной и периферической нервных систем. В завершающую фазу заболевания может отмечаться выздоровление с угасанием неврологической симптоматики, хронизация патологического процесса или гибель больных. Возможно длительное латентное вирусоносительство, персистенция или хроническая форма инфекции.

Системный клещевой боррелиоз, или болезнь Лайма, – природно-очаговое трансмиссивное заболевание, возбудителем которого является грамотрицательная бактерия Borrelia burgdorferi семейства Spirochaetaceae. Заражение человека может происходить после укусов иксодовых клещей, инокуляции боррелий со слюной клеща, при раздавливании внедрившегося насекомого, также возможна трансплацентарная передача возбудителя от матери к плоду.

Инкубационный период заболевания может длиться от 3 до 32 дней, по данным некоторых авторов до 60 дней. Клещевой боррелиоз имеет разнообразные клинические проявления. В первую фазу заболевания, фазу локальной инфекции, отмечаются лихорадка, интоксикация, головные боли, распространенная "мигрирующая" эритема на месте контакта клеща с кожей больного, регионарный лимфаденит. В фазу гематогенного и лимфогенного диссеминирования боррелий отмечается поражение органов и систем с развитием разнообразной клинической картины заболевания. Отмечается поражение опорно-двигательной, нервной, сердечно-сосудистой систем, глаз, печени, почек, кожи.

Гранулоцитарный анаплазмоз человека (ГАЧ) - возбудитель этого заболевания Anaplasma phagocytophilum   был впервые описан у человека в 1990 году. Первоначально и до 2001 года данная бактерия была отнесена к эрлихиям (E. phagocytophila и E. equi), которые вызывают сходное по клиническим проявлениям трансмиссивное заболевание.

По данным литературы инфицированность иксодовых клещей возбудителями ГАЧ, в России составляет 6-19%.

Начальная стадия заболевания обусловлена внедрением возбудителя в организм человека через кожу, при этом первичный аффект, как правило, отсутствует. В клеще-переносчике возбудитель размножается в слюнных железах и клетках кишечника. Со слюной клеща возбудитель проникает в подлежащие ткани кожи и распространяется гематогенным путем по всему организму.

Инкубационный период колеблется от 3 дней до 3 недель (в среднем  14 дней). Большинство случаев заболевания регистрируется у взрослых, клинические проявления анаплазмоза, возможно, связаны со степенью патогенности возбудителя. Тяжесть болезни варьирует от легких до тяжелых форм, при этом у пожилых людей и пациентов с иммунодепрессией (ВИЧ и др.) болезнь протекает тяжелее. Клиника характеризуется полиморфизмом и напрямую зависит от возраста пациента и сопутствующей патологии. Легкие формы заболеваний проявляются в виде недомоганий, напоминающих синдром респираторной инфекции. В манифестной форме заболевание начинается остро, с высокой лихорадки с ознобом, слабости, тошноты, головной боли, миалгий, артралгий и других симптомов интоксикации, напоминающих ОРВИ. Нередко пациенты предъявляют жалобы на боль в горле, першение и кашель. Иногда отмечаются потеря аппетита, боли в животе, рвота, диарея, чувство тяжести в правом подреберье. В более тяжелых случаях наблюдаются неврологические нарушения, общемозговые симптомы, кровотечения, затрудненность дыхания, почечная недостаточность, расстройства функции желудочно-кишечного тракта. Со стороны сердечно-сосудистой системы чаще отмечается брадикардия и понижение артериального давления. На ЭКГ отмечаются признаки нарушения проводимости миокарда. Нередко отмечается поражение печени в виде безжелтушного гепатита, с повышением активности печеночных трансаминаз при нормальных показателях билирубина в биохимическом анализе крови. Поражение почек проявляется в виде нефропатии,  отмечается повышение уровня креатинина и мочевины в сыворотке крови. Иногда может развиться менингоэнцефалит. Высыпания на коже для ГАЧ не характерны и чаще свидетельствуют о микст-инфекции. Продолжительность лихорадочного периода колеблется от нескольких дней до 3 недель.

Моноцитарный эрлихиоз человека (МЭЧ) – возбудителями заболевания являются внутриклеточные бактерии Ehrlichia chaffeensis и Ehrlichia muris. Первый случай МЭЧ был выявлен в США в 1986 году. Позднее было установлено,  что Ehrlichia chaffeensis встречается в основном в странах Европы, Северной Америки, Африки и Восточной Азии,  в Российской Федерации распространены очаги Ehrlichia muris. На территории Пермского края генетический материал Ehrlichia muris был впервые обнаружен в клещах Ixodes persulcatus в 1997 году.

Для моноцитарного эрлихиоза человека характерно развитие выраженного общеинтоксикационного синдрома в острый период заболевания: высокая температура, сопровождающаяся ознобом, головной и мышечной болью, артралгиями, абдоминальной болью. Поражение нервной системы может проявляться головокружением, тошнотой, рвотой, гиперестезией, недостаточностью лицевого нерва, асептическими менингитами. Примерно в 30% случаев регистрируется двухволновое течение. У части больных наблюдаются катаральные явления со стороны дыхательных путей, в редких случаях на теле  появляется пятнисто- папулезная сыпь.

В патологический процесс вовлекается сердечно-сосудистая система (сердцебиение и приглушение тонов сердца, повышение артериального давления). Поражение печени выявляется более чем в половине случаев и характеризуется как увеличением ее размеров, так 3–4-кратным повышением активности трансаминаз. Для клинической картины крови в острый период характерны лейкопения, относительная и абсолютная лимфоцитопения, тромбоцитопения, анемия. К более редким осложнениям относят острую почечную недостаточность, инфекционно-токсический шок, интерстициальную пневмонию.

Ввиду общего механизма заражения возбудителями МЭЧ и других инфекций, передающихся иксодовыми клещами, нередко происходит развитие разнообразных смешанных заболеваний. В связи с этим клиническая диагностика в остром периоде «клещевых» инфекций значительно затруднена, а на первое место в верификации заболеваний выступает лабораторная диагностика.

Одним из методов лабораторной диагностики, который позволяет выявлять в биологическом материале фрагменты генетического материала (ДНК, РНК) возбудителей инфекций является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).  Исследование обладает целым рядом преимуществ по сравнению с другими методами идентификации клещевых инфекций: быстрота получения результата, высокая чувствительность метода, высокая специфичность. Специфичность метода особенно важна для дифференциальной диагностики клещевых инфекций. Известно, что,  серологические тесты на клещевые инфекции могут давать ложноположительный результат из-за наличия перекрестных реакций, обусловленных общими антигенными свойствами указанных микроорганизмов. Так как, в ПЦР используются специфические для каждого из микроорганизмов праймеры (короткие фрагменты одноцепочечной ДНК, обычно, состоящие из 20 нуклеотидов) вероятность ложноположительного результата гораздо ниже. Материалом для исследования в ПЦР могут быть различные биологические жидкости человека - плазма крови, лейкоцитарная фракция, ликвор. Несмотря на высокую чувствительность ПЦР, имеются ограничения этого метода, связанные с недостаточным, иногда кратковременным, накоплением возбудителя или его ДНК в различных биологических жидкостях и тканях человека. Поэтому диагностическая чувствительность ПЦР значительно варьирует в зависимости от выбранного клинического материала, а также сроков обследования пациента.

 По данным литературы  РНК вируса  клещевого энцефалита  обнаруживается  в крови пациентов с лихорадочной формой заболевания в 44,7% случаев, а  при менингеальной - у 70% больных. В диагностике клещевого энцефалита метод ПЦР информативен в первые дни заболевания (первая волна лихорадки), спустя 5-7 дней РНК вируса обнаружить чаще всего уже не удается.

 Средний показатель чувствительности ПЦР метода выявления ДНК Borrelia burgdorferi по результатам шести исследований проведенных в 2005 году в Европе и США, составил 14%.   Такой незначительный процент выявления ДНК связывают с непродолжительной и неинтенсивной спирохетемией при гематогенной диссеминации возбудителя. В первую неделю заболевания (1-7 день)  ДНК боррелий в  крови обнаруживается лишь у 11,6% пациентов вне зависимости от формы заболевания, что объясняется  накоплением возбудителя в месте его первичного проникновения. В более поздний период заболевания - на 8-14  день ДНК боррелий  удается обнаружить в крови пациентов более часто. Следует отметить, что только отсутствие специфических антител, а не «отрицательный результат ПЦР», в первые три месяца после предполагаемого инфицирования является доказательством отсутствия инфицированности.

Чувствительность ПЦР исследования крови при ГАЧ по данным литературы  составляет 60-70%, при этом отмечено, что она  резко снижается на фоне антибиотикотерапии.  

Сроки обнаружения геномного материала возбудителей моноцитарного эрлихиоза в крови пациентов варьируют от 1 до 58 дней с момента заболевания. Наибольшая результативность ПЦР (до 69,4 % положительных проб) отмечается с 1 по 7 дни болезни. Также необходимо учитывать, что возможность получения ложноотрицательного результата за счет лейкопении, которая характерна для моноцитарного эрлихиоза человека.

 

ПОДГОТОВКА К ИССЛЕДОВАНИЮ

Вирусемия при клещевом энцефалите имеет двухволновый характер, поэтому данное исследование рекомендуется выполнять в сроки, определенные лечащим врачом по направлению.

 

Кровь рекомендуется сдавать не ранее чем через 4 часа после последнего приема пищи (воду пить можно).

 

Материал для исследования: цельная кровь.

 

ПОКАЗАНИЯ

• Диагностика клещевого энцефалита, боррелиоза, гранулоцитарного анаплазмоза, моноцитарного эрлихиоза человека.
• Наличие у пациента гриппоподобного синдрома (лихорадка, головная боль, миалгии и артралгии) при наличии эпидемиологического анамнеза: присасывание клеща, посещение лесной зоны, употребление в пищу сырого козьего молока.

 

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Интерпретация результатов содержит аналитическую информацию для лечащего врача. Лабораторные данные входят в комплекс всестороннего обследования пациента, проводимого врачом и не могут быть использованы для самодиагностики и самолечения.

 

Исследование предполагает определение в крови фрагментов генетического материала (ДНК, РНК) возбудителей клещевого энцефалита, боррелиоза, моноцитарного эрлихиоза, анаплазмоза человека. Тест является качественным, результат выдается в терминах «обнаружено», «не обнаружено».

Причины отрицательного результата:

• отсутствие инфицирования клещевыми инфекциями;
• содержание возбудителя в исследуемом материале ниже уровня детекции;
• ложноотрицательные результаты.